NanoDrop微量分光光度计的应用

NanoDrop微量分光光度计的应用

快速评估您的样品中所含的核酸、蛋白质和污染物

当您知道样品的含量和纯度时，您便可以做出是否在下游实验中使用这些样品的明智决策。Thermo Scientific NanoDrop 分光光度计系列可以帮助您快速评估样品中是否含有适量您所需的物质。根据您选择的仪器，软件还可以在存在污染物时提醒您并鉴别污染物是什么。

NanoDrop 分光光度计的核心功能是核酸和蛋白质定量分析与纯度评估，这是许多下游应用（特别是 RT-qPCR 和质量控制）中的步骤。另外，该仪器还支持细菌培养生长、动力学等应用以及液体聚合物 QC 等化学计量应用

核酸定量

传统上，通过测定以下三个分析波长处的紫外吸光度来定量核酸：230 nm、260 nm 和 280 nm。这些吸光度测量允许科学家测定核酸浓度并指示样品纯度。260 nm 处的最大吸光度峰的强度与核酸浓度成正比。

该核酸定量方法的优势在于操作简单、直接，仅消耗少量样品。然而，该方法存在的一个问题是它缺乏特异性，因为在这些波长处存在吸收的任何污染物都会导致获得的核酸浓度不准确。

随着紫外-可见光软件的发展，研究人员现在可以在存在化学和核酸污染物的情况下选择性地定量核酸吸光度。Thermo Scientific Acclaro 智能技术软件（赛默飞NanoDrop One/OneC 和 NanoDrop Eight 分光光度计中的标准软件）使用全光谱数据和高级的算法来鉴别常见的核酸污染物并提供经过校正的核酸浓度。Acclaro 算法可以检测 RNA 中的 dsDNA 污染以及 dsDNA 中的 RNA 污染。您还可以输入自定义寡核苷酸序列，软件将自动计算应用于核酸定量的因子。

NanoDrop One/Oneᶜ 分光光度计上的预编程核酸应用

点击以从核酸主屏幕中选择您需要的应用。

标记核酸的定量

荧光标记的核酸可通过微阵列预配置软件方法进行定量，该方法可提供核酸浓度及标记浓度（支持两种染料）。该方法作为 NanoDrop One/OneC 和 NanoDrop Eight 仪器上的预配置应用提供。

污染物鉴别

Acclaro 样品智能技术使得 NanoDrop One/OneC 和 NanoDrop Eight 微量分光光度计能够鉴别常见污染物并提供真实的样品浓度，从而提供有关样品质量的更多信息。Acclaro 软件纳入了依赖于光谱参考库的算法。该软件将这些算法应用于样品光谱，并使用化学计量数学原理对样品污染物进行预测。

Acclaro 污染物鉴别

Acclaro 软件已标记该 dsDNA 样品（黄色图标），因为它被苯酚污染。从原始结果（总 A260，蓝色）中减去苯酚的吸光度贡献（橙色），得到了样品中经过校正的真实 dsDNA 浓度（绿色）。

Acclaro 参考库目前支持检测 dsDNA 样品中的蛋白质、苯酚、盐酸胍和 RNA。另外还支持检测 RNA 样本中的蛋白质、苯酚、硫氰酸胍和 dsDNA。最后，它们允许检测蛋白质样品中的 DNA。未来将在参考库中增加其他污染物。

污染物鉴别为研究人员提供了两个方面的重要信息。首先，它可以鉴别可能存在于样品中的特定污染物。此信息可能有助于科学家解决较难的提取或纯化问题，并做出关于是否在下游实验中使用样品的决策。其次，它提供了经过校正的分析物浓度。当建立下游反应（例如 PCR）时，DNA 浓度是一个关键参数，经过校正的浓度将有助于科学家确保下游实验的成功。

例如，基因组 DNA 制备中出现 RNA 污染是分子生物学工作流程中的一个常见问题。使用传统的分光光度法时，存在共纯化的 RNA 会人为升高 DNA 浓度。通过使用全光谱数据和 Acclaro 软件中提供的数学算法，研究人员可以鉴别 DNA 样品中的 RNA 污染，并查看经过校正的 DNA 浓度结果。

RT-qPCR 工作流程中的核酸定量

可靠的 RT-qPCR（定量逆转录 PCR）检测需要仔细的实验设计、全面的质量控制 (QC) 以及透明的数据分析。

RT-qPCR QC 中核酸定量的重要性

核酸定量在 RT-qPCR 过程的两个酶法步骤中都至关重要。在逆转录步骤中，了解（和归一化）进入反应的 RNA 量将有助于大大减少 cDNA 生产的变异性。在 PCR 步骤中，您必须确保有足够的 cDNA 模板来确定样品的基因型。

将 NanoDrop 分光光度计用于 qPCR 工作流程

NanoDrop One 和 NanoDrop Eight 分光光度计非常适合定量和定性分析核酸样品，作为下游 RT-qPCR 检测的质量控制步骤。这些仪器可提供准确的核酸浓度并鉴别可能改变实验结果的污染物，有助于防止实验失败或不能发表结果。

NanoDrop One 和 Eight 仪器内置的 Acclaro 样品智能技术可鉴别样品中是否存在常见污染物并计算出污染物的近似浓度。核酸提取试剂盒中的常见分子可能会导致分析物浓度值被高估或使 qPCR 聚合酶变性。无论发生哪种情况，qPCR 实验都可能失败。Acclaro 软件可以提供经过校正的核酸浓度且可鉴定污染物，从而较大限度地减少对失败实验进行故障排除和管理所花费的时间。

蛋白质定量分析

科学家可以使用 NanoDrop 仪器，通过直接或间接测量法定量分析样品中的蛋白质含量。NanoDrop 紫外-可见光分光光度计支持在光谱的紫外波长范围内使用直接 A280 和 A205 测量应用以及在可见光谱范围内使用比色检测对蛋白质样品进行定量分析。

NanoDrop One/Oneᶜ 分光光度计上的预编程蛋白质应用

点击以从蛋白质主屏幕中选择您需要的应用。

蛋白质 A280 是一个直接测量应用程序，可直接根据样品在280或205 nm 处的吸光度以及蛋白质特定消光系数来计算蛋白质浓度。直接测量是一种受研究人员欢迎的选择，因为其操作简单，不需要试剂或标准品，并且只消耗极少量样品。与核酸不同，蛋白质显示出相当大的差异。蛋白质 A280 应用适用于含有色氨酸 (Trp) 或酪氨酸 (Tyr) 残基、半胱氨酸二硫键 (Cys-Cys) 并在280 nm 处显示吸光度的纯化蛋白质。

比色检测（如 BCA、Bradford、Lowry 和 Pierce 660 nm ）是 间接测量应用，它们依赖生成标准曲线和产生可显示与样品中的蛋白质量成比例的颜色变化的反应。细胞提取物或裂解物等复杂混合物中的蛋白质建议使用蛋白质比色检测进行测量。

蛋白质样品评估是许多蛋白质工作流程中的一个重要步骤。

为蛋白质或肽样品选择适合的定量检测

下列表格显示了 NanoDrop 紫外-可见分光光度计上可用的蛋白质定量方法的浓度范围、描述和注意事项以及不同仪器上提供的各种方法。有关这些检测的更多信息，请参阅我们的蛋白检测选择指南

NanoDrop 分光光度计支持的蛋白质检测方法

A280 可实现对大多数蛋白质和肽的快速简单定量分析

纯化蛋白质样品可以使用 280 nm 处的直接吸光度进行准确测量，此处的吸光度主要归因于 Trp 和 Tyr 氨基酸上的芳香链。蛋白质 A280（我们软件中的一种预配置应用）是较常用的定量方法，因为它快速简单、不需要试剂或标准曲线，且样品消耗量极少。

与核酸不同，每种纯蛋白质都具有基于氨基酸序列的比尔-朗伯消光系数。为了获得准确的结果，请从菜单中选择正确的样品类型，或手动输入其蛋白质消光系数。NanoDrop One 和 NanoDrop Eight 蛋白质编辑器功能使您能够保存特定蛋白质的消光系数，以便您能够自定义您的样品类型选项。

除测量浓度外，NanoDrop 分光光度计还可提供样品中污染物的相关信息。Acclaro 样品智能技术（包含在 NanoDrop One/OneC 和 NanoDrop Eight 仪器上）使用数学算法来检测蛋白质样品中的核酸，并根据需要校正浓度结果。也可以通过测量 A260/A280 比值来评估样品纯度；比值 >1 可能表明蛋白质样品中存在核酸污染。

A205 是一种直接测量选择方法，甚至适用于不含酪氨酸和色氨酸的生物分子

如果蛋白质或肽不含 Trp 和 Tyr 残基因此不能使用 A280 应用进行测量该怎么办？由于蛋白质的肽骨架在 190-220 nm 处吸收光，因此不含 Tyr 或 Trp 残基的肽可以通过测量 205 nm 处的吸光度来进行定量分析。蛋白质 A205 是 NanoDrop 软件中的一个预配置应用。

也可以通过选择 Scopes 法选项，使用 A205 应用对含有大量 Trp 和 Tyr 的蛋白质进行定量。事实上，A205 方法相比 A280 蛋白质方法具有一些优势，比如蛋白质间变异性较低（因为 A205 消光系数并不基于氨基酸组成）和灵敏度更高（因为蛋白质在 205 nm 处具有较高的摩尔吸光系数）。尽管技术上的限制使得这些测量在过去很难进行，但 Nanodrop 仪器的样品保留技术和低杂散光性能简化了通过 A205 方法定量少量蛋白质的流程。

A205 方法存在的一个局限性是许多常用的蛋白质缓冲液在 205 nm 处有吸光度。在使用这一技术之前，建议检查蛋白质缓冲液在 205 nm 处的吸光度贡献。

细胞提取物或裂解物中蛋白质的比色检测

细胞提取物或裂解物等复杂混合物中的蛋白质建议使用蛋白质比色检测进行测量，如 Bradford、BCA、Lowry 或 Pierce 660nm 检测。这些检测可提供蛋白质特异性浓度，避免了在紫外范围内吸光并会使 A280 增大的细胞组分的吸光度。这些应用和其他应用已预配置在选定的 NanoDrop 仪器上。

使用 NanoDrop One/Oneᶜ 分光光度计进行 BCA 蛋白质检测

BCA 检测结果显示总蛋白浓度（3 个红色菱形）和标准曲线。

标记蛋白质的定量

标记的抗体或其他荧光标记的蛋白质和金属蛋白可以使用提供蛋白质以及标记浓度（支持 2 种染料）的蛋白质和标记预配置软件应用进行定量。该应用作为 NanoDrop One/OneC 和 NanoDrop Eight 分光光度计上的预配置应用提供。

质量控制实验室

现在，质量保证和质量控制比以往任何时候都更加重要。在繁忙的 QC 实验室中，NanoDrop 分光光度计可使样品浓度和纯度分析变得可重现、常规和可靠。将下一代样品质量评估集成到您的工作流程中产生了很大影响，因为时间非常宝贵，所有样品的质量都至关重要。

mRNA 疫苗质量控制

例如，在 mRNA 疫苗（在对抗 SARS-CoV-2 中至关重要并且越来越多地用于对抗其他病毒）的生产过程中，样品浓度和纯度检查在多个步骤中都非常有用。

在测序阶段，起始材料的质量和数量都是获得准确结果的关键。

在质粒生产中，必须检查纯化血浆是否存在基因组 DNA 和其他污染物。

在体外转录中，必须先检查纯化 mRNA 的纯度，然后再将 mRNA 溶液灌装到疫苗小瓶中。

细菌培养生长 (OD600)

可通过测量细菌培养物在 600 nm 处的光密度 (OD600) 来监测细菌培养物的生长。尽管这是微生物学中的核心技术，但这些光学密度测量通常只能提供非常少的真实化学吸光度。相反，它们代表了由于细菌悬液散射而未进入仪器的检测器的光量。

您可以使用 OD600 预编程应用在 NanoDrop OneC 和 NanoDrop Eight 分光光度计上测定 OD600。该软件使用比尔-朗伯方程和用户输入的细胞数转换系数自动将 OD600 值转换为每毫升细胞数。

请注意，在 NanoDrop OneC 仪器上，使用底座和比色皿选件将提供不同的 OD600 值。您可以使用转换系数来比较基座和比色皿测量值。

基于时间的动力学测量

在 NanoDrop OneC 仪器上，您可以对比色皿中的样品进行基于时间的动力学测量。您可以190-850 nm 范围内的三个波长，按照用户自定义的时间间隔（最多 5 个阶段）进行连续的吸光度监测。比色皿测量提供扩大的检测下限、可选的37°C加热器和微型搅拌器。

您可以创建、编辑和保存动力学实验作为自定义方法。

样品动力学结果

使用 NanoDrop OneC，按照用户定义的时间间隔在 10 分钟内检测了该比色皿样品在 260、340 和 660 nm 处的吸光度。

NanoDrop 分光光度计的自定义方法

如上文所述，NanoDrop 分光光度计预加载了核酸定量（如 dsDNA、ssDNA 和 RNA）和蛋白质定量（如 A280、BCA 和 Bradford）方法。您还可以在 NanoDrop One/OneC 或 NanoDrop Eight 分光光度计上创建自定义方法来进行紫外-可见光测量或其他用户定义的测量以满足您的需求，使仪器能够像传统分光光度计一样发挥作用。自定义方法可以监测和报告 190-850 nm 范围内的多达 40 个波长，并可以直接从触摸屏或 PC 控制软件进行设置。自定义方法支持将您的仪器灵活用于其他应用。

使用预先定义的自定义方法 来分析样品，如通过 BCA 检测分析纳米颗粒、叶绿素、血红蛋白、葡萄糖和蛋白质。

创建新的自定义方法来分析您的特殊样品，并保存方法供日后使用。

使用自定义方法测量各种形式的血红蛋白

例如，利用合适的消光系数和吸光度峰值，分光光度计可用来定量各种形式的血红蛋白。

氧合血红蛋白含有结合氧，在 414 nm、541 nm 和 576 nm 处显示吸光度峰。

脱氧血红蛋白不含结合氧，在 431 nm 处显示吸光度峰。

高铁血红蛋白由于含有高铁离子而不能结合氧，在 406 nm 处显示吸光度峰。

我们为 NanoDrop One/OneC 仪器创建了一种自定义方法，用于测量血红蛋白在 406、414、431、541 和 576 nm（区分氧合血红蛋白、脱氧血红蛋白和高铁血红蛋白所需的五个波长）处的吸光度。该结果图显示了高铁血红蛋白的典型吸收光谱。

高铁血红蛋白的典型吸收光谱

在 NanoDrop One 分光光度计上运行血红蛋白自定义测量方法，结果显示在 406 nm 处有吸收峰，这是高铁血红蛋白的典型峰。另外，光谱未显示氧合血红蛋白中存在的 541 和 576 处的吸收峰。

化学计量方法

化学计量学是使用多变量数学模型和统计方法来同时确定很多组分的定量浓度信息。当用于分析复杂化学样品（混合物）的紫外-可见光数据时，化学计量学可以提供一种有效的方法来测定具有重叠光谱的化学物质的浓度。 过去，多变量校准模型的复杂性限制了其只能由拥有相关领域丰富知识的人使用，因此大多数数据必须传输给经验丰富的化学计量学专家进行收集后分析。

NanoDrop QC 软件纳入了化学计量学

Thermo Scientific NanoDrop QC 软件为 NanoDrop OneC 微量测量平台带来了强大的化学计量分析功能。这种组合方式提供了一种具有吸引力的解决方案，适用于各种应用，包括石化分析、药物纯度、聚合物制造、食品染料应用以及需要化学计量分析的其他应用。

NanoDrop QC 软件简化了化学计量方法的开发和部署。开发方法的科学家可以收集所选化合物的光谱并将其导入 Thermo Scientific TQ Analyst 软件，用于构建方法。然后，可以将方法直接部署到的NanoDrop OneC 紫外-可见分光光度计上，使 QC 技术人员能够在工作场地获得合格/不合格和其他定量结果。

使用化学计量学方法对液体聚合物进行 QC

基于比色皿的紫外-可见光技术和基于 PC 的化学计量软件是对染料、润滑剂和粘合剂等液体进行质量分析的主要工具。这些溶液的样品制备和分析可能包括多个影响高价值产品放行的耗时步骤。我们的创新型自动调节基座紫外-可见分光光度计省去了稀释高浓度样品等耗时的步骤，并简化了化学计量方法开发数据分析。

定量分析复杂混合物，即使其光谱重叠

在我们的化学计量学应用资料中，我们演示了逐步创建并验证用于确定复杂混合物中单种偶氮染料的浓度的化学计量学方法。我们展示了如何使用 NanoDrop QC 软件来获取包含多种具有高度重叠紫外-可见光光谱的组分的样品的定量信息。

纯柠檬黄和日落黄的全紫外-可见光谱 (200-700 nm)

使用 NanoDrop QC 软件的紫外-可见光模块采集光谱，并在 800 nm 处进行基线校正。制备每种染料的 10 mg/mL 和 2 µL 等分溶液，并在仪器上测量。