使用Cary 3500表征抗体药物偶联物的关键质量属性

摘要抗体药物偶联物 (ADCs) 是一类快速增长的生物治疗药物。在生产过程中，需要监测ADCs 的关键质量属性 (CQAs)，例如药物/抗体比率 (DAR) 和聚集体。本应用简报展示了 Agilent Cary 3500 紫外-可见多池分光光度计在分析 ADCs 的 DAR 和聚集指数方面的功能优势，以及在多种温度下同步测量多个样品的功能。Cary 3500 紫外可见分光光度计凭借软件中的自定义方程功能、简单的方法和准确的温度控制，能够轻松、可靠地测定 DAR 和聚集指数。

前言ADCs 凭借特异性和靶向作用模式，成为制药公司药物研发管线中快速增长的一类生物治疗药物[1]。通过测定 DAR 可确定与每个抗体偶联的细胞毒性小分子的平均数量，该值对产品的安全性和有效性有很大的影响，因此通常被视为一种 CQA。研究表明，DAR 还会显著影响产物形成聚集体的趋势[2]，从而引起免疫反应。因此，在开发过程中分析 ADCs 的 DAR 和聚集体至关重要。紫外-可见光谱是生物制药实验室中的一种常用技术，常用于可靠、便捷地测定蛋白质浓度。在本应用简报中，我们证明了只要细胞毒性小分子含有紫外-可见发色团，并且其最大吸收波长与抗体支架不同，那么紫外-可见光谱法也可用于测定ADC 的 DAR[1]。Cary 3500 紫外-可见分光光度计使用简单快捷，具有高通量，并且可同时在四种不同的温度下为四对比色皿提供准确的温度控制。同步测量多个样品的紫外吸光度可消除不利变量，提高所生成结果的可靠性。简单的方法设置和定制计算功能便于用户使用。Cary 3500 紫外-可见分光光度计与 Agilent OpenLab软件套装兼容。在配置 OpenLab 软件后，它可以支持实验室遵循 FDA 21 CFR Part 11 法规认证指南。在本研究中，我们展示了 Cary 3500 紫外-可见分光光度计在测定 DAR 和聚集指数方面的优势。

实验部分仪器Agilent Cary 3500 紫外-可见多池分光光度计，配有八个比色皿位置。使用 Cary UV Workstation 软件（1.0.1284 版）和Cary 3500 多区控温附件进行数据采集，所用参数如表 1 所示。

赫赛汀及其 ADC 类似物购自新加坡当地的经销商。两种单克隆抗体 (mAb) 样品均使用 Vivaspin 500 超滤浓缩离心管离心柱 (10 kDa MWCO; Sartorius) 进行浓缩。安捷伦矩形 UV 比色皿，10 mm，700 µL，开口（货号 5061-3391）与 Cary 3500 紫外-可见分光光度计配套使用。新制超纯水产自配置 0.22 µm 膜式终端过滤器 (Merck Millipore)的 Milli-Q Integral 水纯化系统。

方法实验中所用赫赛汀及其 ADC 类似物的浓度为 0.5 mg/mL。为了演示 DAR 值的变化，以不同的比例混合赫赛汀及其 ADC 类似物（见图 2 中的表格），并使用 Cary 3500 紫外-可见分光光度计进行测量。使用 Cary UV Workstation 软件中的公式 1 计算 DAR。为了研究温度对 DAR 的影响，使用多区控温附件平行进行了四个实验（图 1）。使用 280 nm 处的紫外吸光度，估算得到本实验中所用的“经离心柱浓缩”ADC 的浓度为 25 mg/mL。对于 25 mg/mL 样品，用 390 µL 水将 10 µL 样品稀释 40 倍。将稀释后的 400 µL ADC 转移到四个比色皿中，用 Cary 3500紫外-可见分光光度计在 60、70、80 和 90 °C 下同步孵育90 分钟。在进行基线校正后测量样品的吸光度，并用公式 1计算 DAR 值。为了研究聚集效应随时间的变化，用 390 µL 水将 10 µL25 mg/mL 的样品稀释 40 倍。将稀释后的 400 µL ADC 转移到比色皿中，在 Cary 3500 紫外-可见分光光度计中孵育 90 分钟，并以不同的时间间隔测量样品的吸光度。使用公式 2 计算聚集指数。

结果与讨论使用 Cary 3500 紫外-可见分光光度计测定药物/抗体比率为了模拟 ADC 的偶联过程，将 ADC 和游离抗体以不同的比例混合，并使用 Cary 3500 紫外-可见分光光度计测定 DAR。图 2 显示了 ADC 和未偶联抗体混合物的紫外-可见光谱图。使用公式 2 计算 DAR。ADC 的药物分子 DM1 在 252 nm 处有强吸收，与赫赛汀主要发色团在 280 nm 处的吸收不同[4]，如图 2 所示。正如预期的那样，DAR 值随着溶液中 mAb 和 ADC的比例不同而发生变化。