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利用高光谱受激拉曼散射显微技术发现人类肝癌中饱和脂肪的异常积聚
2022年06月01日 11:26
来源：北京心联光电科技有限公司
人类癌症中存在脂质代谢失调现象，传统观点认为不饱和脂质的积聚会有利于肿瘤细胞存活和增殖。但目前还没有成熟的分析工具能够以高分辨率对未加工人体组织中的代谢物进行识别及定量。来自华中科技大学的Shuai Yan等人使用分析性高光谱激发的拉曼散射显微术，对24名肝癌患者的正常组织和癌性肝组织中的脂质代谢物进行了原位绘谱。发现与传统观点正相反，癌性肝组织中积聚了大量的饱和脂肪，而癌性肝组织周围的正常组织中几乎没有发现这种聚集现象。使用质谱进一步分析发现，癌性肝脏中甘油三棕榈酸酯含量非常高。这表明饱和脂肪的异常积累很有可能是肝癌的代谢生物标志。该研究以“Hyperspectral Stimulated Raman Scattering Microscopy Unravels AberrantAccumulation of Saturated Fat in Human Liver Cancer“为题发表在Analytical Chemistry。
本文从24名肝细胞癌患者中收集了正常组织和癌性肝组织，并进行高光谱SRS成像，得到饱和脂肪、不饱和脂肪、蛋白质的拉曼图谱。观察分析发现与正常肝组织相比，癌性肝组织中饱和脂肪出现大量异常积聚。使用质谱技术进一步研究发现与正常组织相比，癌性肝组织中甘油三棕榈酸酯(饱和脂肪的一种典型形式)的积累显著增加。这些发现表明，饱和脂肪在肝癌的发展中起着关键作用，可能是肝癌诊断的潜在标志，打破了癌细胞依靠不饱和脂肪生存和增殖的传统观点。
图1b为对应CH区域的自发拉曼光谱：在①2853 cm-1位置TP（深黄色）和TO（绿色）都出现CH2峰；在②2885 cm-1处只有含长直酰基链的TP出峰；④3007 cm-1位置为不饱和=CH，TO出峰；BSA在③2935 cm-1处出峰。虽然几种物质的化学结构之间的差异很细微，但通过不同的拉曼带可以明显区分。
研究人员对TP、TO和BSA组成的混合物模进行了高光谱SRS成像，使用多元曲线分辨率(m*riate curve resolution, MCR)算法重建出TP、TO和BSA的空间分布图(图1c)，并制作了优化的SRS光谱(图1d)。得到的SRS光谱保留了所有振动拉曼带的关键特征，包括TP的2885 cm-1 (②)和TO的3007 cm-1 (④)，并与自发拉曼测量的相应光谱非常一致(图1b)。虽然自发拉曼光谱光谱分辨率更好，因为有高性能光栅且积分时间较长(约10秒)，但高光谱SRS特别适合对生物组织中化学物质进行快速绘图，能够通过其内在的化学振动，对复杂生物组织中的饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸进行识别并成像。
验证了概念可行性后，研究人员从24名肝癌患者中获得了癌性肝组织及其邻近正常组织的标本，用超光谱SRS显微和MCR进行分析检测，发现了三种含较为量显著的化学成分。
图2c-e为主要代谢成分的MCR重建浓度图，图2a为彩色重叠图像，能更好地理解它们的相对空间分布。可直接观察到有两种类型的脂肪(黄色和绿色)在癌性肝组织中有显著积累。图2c为第一种类型的脂质成分，它以不规则形状的块状和液滴形式存在，对应非常强的拉曼带并在2885 cm-1处出现峰值，展示出饱和脂肪特征(②)，同时在3007 cm-1 (④)处的去饱和作用曲线平坦，表明反射光谱中没有=CH振动。图2d为第二种脂质浓度图，光谱显示不饱和脂质特性，在3007 cm-1处有明显的拉曼带，主要储存在细胞内的脂滴中。MCR算法分析出的第三种化学成分为蛋白质，光谱主要在CH3的2935 cm-1处出峰(③品红色)，且蛋白质在饱和脂肪（图2c）之外的位置中分布更均匀(图2e)。
为了更好地理解成分变化，研究人员收集了图2c、d中五个不同位置的SRS光谱。发现在S1、S2和S3位置，饱和脂肪特点非常突出(图2f)。其微观形状更接近致密的圆形脂滴(图2c)。但S4和S5位置为饱和脂肪和不饱和脂肪的混合物。同时从形态学上看，其通常具有不规则的形状，在浓度图中作为大尺寸的脂质块存在。在图2d不饱和脂肪的MCR重建图像中还发现了不同位置的一定程度的光谱变化。在U1、U2和U3位置，展示出不饱和脂肪的特征(图2g)。SRS浓度图中，它们的大小较小，呈规则的圆形，可能是脂滴。然而在U4和U5位置，蛋白质可能在空间上与不饱和脂肪重叠。后续通过计算光谱差异验证了这一假设。因此可以认为这些是脂质和蛋白质的聚集体，它们也以不规则形状的斑块形式出现(图2d)。
从上述分析结果来看，癌性肝组织中有两种含量较多的脂质。在脂滴中存在大量的饱和脂肪，而且有些会与不饱和脂质混合在一起。而不饱和脂肪大多伴有细胞内蛋白质。
为从更大面积上证实癌性肝组织确实较正常肝组织储存了更多的饱和脂肪，研究人员对约500 × 500 μm2大小的癌性组织和正常组织进行了高光谱SRS成像研究。
图3 癌性肝组织及其周围正常肝组织的高光谱SRS成像。（a-b）25号患者癌性组织和正常组织的图像。黄色为饱和脂肪，绿色为不饱和脂肪，品红色为蛋白质。
图3a为16幅高光谱SRS图像及其MCR重建图像结合生成的大比例尺浓度图。分析发现在癌组织中饱和脂肪(黄色)广泛分布，但邻近的正常肝组织中，饱和脂肪较少(图3b)。而且正常组织中的肝细胞组织良好，细胞形态清晰。
最后研究人员检测了24名患者的组织样本，每个样本随机选择1-3个不同的位置进行SRS成像并通过MCR重建图像中饱和脂肪的面积进行定量。
图4a为每个样本观察区域的饱和脂肪统计量。可见癌性肝组织中，饱和脂肪的平均面积分数约为12.21%，其中有两例患者面积分数甚至高达约40%，而在正常肝组织中仅约0.17%，即大多数正常组织检查部位中没有观察到饱和脂肪积聚。随后研究人员使用质谱仪定量分析了11名患者的癌性肝组织和正常肝组织(图4b)，测量了包括甘油三棕榈酸酯(TP，16:0/16:0/16:0)、甘油三油酸酯(TO，18:1/18:1/18:1)和甘油三油酸酯(TL，18:2/18:2/18:2)在内的脂质含量。发现癌性肝组织中的TP含量确实约为正常组织的6倍，正常肝组织中不饱和脂质包括TO和TL的水平也较高。同时在一些患者的正常肝组织中，也观察到了含有不饱和脂肪的大尺寸脂滴。因为在癌组织和正常肝组织中都观察到不饱和脂肪，所以不饱和脂肪可能并不是癌组织所*的。而经高光谱SRS成像和大量数据分析都发现，癌性肝组织中的饱和脂肪含量明显高于正常组织，这表明饱和脂肪很有可能是肝癌代谢生物标志物。
参考文献：Yan, Shuai , et al. "Hyperspectral Stimulated Raman Scattering Microscopy Unravels Aberrant Accumulation of Saturated Fat in Human Liver Cancer." Analytical Chemistry (2018):6362.
研究背景
本文从24名肝细胞癌患者中收集了正常组织和癌性肝组织，并进行高光谱SRS成像，得到饱和脂肪、不饱和脂肪、蛋白质的拉曼图谱。观察分析发现与正常肝组织相比，癌性肝组织中饱和脂肪出现大量异常积聚。使用质谱技术进一步研究发现与正常组织相比，癌性肝组织中甘油三棕榈酸酯(饱和脂肪的一种典型形式)的积累显著增加。这些发现表明，饱和脂肪在肝癌的发展中起着关键作用，可能是肝癌诊断的潜在标志，打破了癌细胞依靠不饱和脂肪生存和增殖的传统观点。
结果与讨论
图1b为对应CH区域的自发拉曼光谱：在①2853 cm-1位置TP（深黄色）和TO（绿色）都出现CH2峰；在②2885 cm-1处只有含长直酰基链的TP出峰；④3007 cm-1位置为不饱和=CH，TO出峰；BSA在③2935 cm-1处出峰。虽然几种物质的化学结构之间的差异很细微，但通过不同的拉曼带可以明显区分。
研究人员对TP、TO和BSA组成的混合物模进行了高光谱SRS成像，使用多元曲线分辨率(m*riate curve resolution, MCR)算法重建出TP、TO和BSA的空间分布图(图1c)，并制作了优化的SRS光谱(图1d)。得到的SRS光谱保留了所有振动拉曼带的关键特征，包括TP的2885 cm-1 (②)和TO的3007 cm-1 (④)，并与自发拉曼测量的相应光谱非常一致(图1b)。虽然自发拉曼光谱光谱分辨率更好，因为有高性能光栅且积分时间较长(约10秒)，但高光谱SRS特别适合对生物组织中化学物质进行快速绘图，能够通过其内在的化学振动，对复杂生物组织中的饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸进行识别并成像。
验证了概念可行性后，研究人员从24名肝癌患者中获得了癌性肝组织及其邻近正常组织的标本，用超光谱SRS显微和MCR进行分析检测，发现了三种含较为量显著的化学成分。
图2c-e为主要代谢成分的MCR重建浓度图，图2a为彩色重叠图像，能更好地理解它们的相对空间分布。可直接观察到有两种类型的脂肪(黄色和绿色)在癌性肝组织中有显著积累。图2c为第一种类型的脂质成分，它以不规则形状的块状和液滴形式存在，对应非常强的拉曼带并在2885 cm-1处出现峰值，展示出饱和脂肪特征(②)，同时在3007 cm-1 (④)处的去饱和作用曲线平坦，表明反射光谱中没有=CH振动。图2d为第二种脂质浓度图，光谱显示不饱和脂质特性，在3007 cm-1处有明显的拉曼带，主要储存在细胞内的脂滴中。MCR算法分析出的第三种化学成分为蛋白质，光谱主要在CH3的2935 cm-1处出峰(③品红色)，且蛋白质在饱和脂肪（图2c）之外的位置中分布更均匀(图2e)。
为了更好地理解成分变化，研究人员收集了图2c、d中五个不同位置的SRS光谱。发现在S1、S2和S3位置，饱和脂肪特点非常突出(图2f)。其微观形状更接近致密的圆形脂滴(图2c)。但S4和S5位置为饱和脂肪和不饱和脂肪的混合物。同时从形态学上看，其通常具有不规则的形状，在浓度图中作为大尺寸的脂质块存在。在图2d不饱和脂肪的MCR重建图像中还发现了不同位置的一定程度的光谱变化。在U1、U2和U3位置，展示出不饱和脂肪的特征(图2g)。SRS浓度图中，它们的大小较小，呈规则的圆形，可能是脂滴。然而在U4和U5位置，蛋白质可能在空间上与不饱和脂肪重叠。后续通过计算光谱差异验证了这一假设。因此可以认为这些是脂质和蛋白质的聚集体，它们也以不规则形状的斑块形式出现(图2d)。
从上述分析结果来看，癌性肝组织中有两种含量较多的脂质。在脂滴中存在大量的饱和脂肪，而且有些会与不饱和脂质混合在一起。而不饱和脂肪大多伴有细胞内蛋白质。
为从更大面积上证实癌性肝组织确实较正常肝组织储存了更多的饱和脂肪，研究人员对约500 × 500 μm2大小的癌性组织和正常组织进行了高光谱SRS成像研究。
图3 癌性肝组织及其周围正常肝组织的高光谱SRS成像。（a-b）25号患者癌性组织和正常组织的图像。黄色为饱和脂肪，绿色为不饱和脂肪，品红色为蛋白质。
图3a为16幅高光谱SRS图像及其MCR重建图像结合生成的大比例尺浓度图。分析发现在癌组织中饱和脂肪(黄色)广泛分布，但邻近的正常肝组织中，饱和脂肪较少(图3b)。而且正常组织中的肝细胞组织良好，细胞形态清晰。
最后研究人员检测了24名患者的组织样本，每个样本随机选择1-3个不同的位置进行SRS成像并通过MCR重建图像中饱和脂肪的面积进行定量。
图4a为每个样本观察区域的饱和脂肪统计量。可见癌性肝组织中，饱和脂肪的平均面积分数约为12.21%，其中有两例患者面积分数甚至高达约40%，而在正常肝组织中仅约0.17%，即大多数正常组织检查部位中没有观察到饱和脂肪积聚。随后研究人员使用质谱仪定量分析了11名患者的癌性肝组织和正常肝组织(图4b)，测量了包括甘油三棕榈酸酯(TP，16:0/16:0/16:0)、甘油三油酸酯(TO，18:1/18:1/18:1)和甘油三油酸酯(TL，18:2/18:2/18:2)在内的脂质含量。发现癌性肝组织中的TP含量确实约为正常组织的6倍，正常肝组织中不饱和脂质包括TO和TL的水平也较高。同时在一些患者的正常肝组织中，也观察到了含有不饱和脂肪的大尺寸脂滴。因为在癌组织和正常肝组织中都观察到不饱和脂肪，所以不饱和脂肪可能并不是癌组织所*的。而经高光谱SRS成像和大量数据分析都发现，癌性肝组织中的饱和脂肪含量明显高于正常组织，这表明饱和脂肪很有可能是肝癌代谢生物标志物。
研究小结
参考文献：Yan, Shuai , et al. "Hyperspectral Stimulated Raman Scattering Microscopy Unravels Aberrant Accumulation of Saturated Fat in Human Liver Cancer." Analytical Chemistry (2018):6362.
高光谱显微系统
作为一种新颖的表征手段，高光谱系统正逐渐在多个领域崭露头角。IMA高光谱显微镜具有优异的光谱和空间分辨率。在扫描样品光谱的同时绘制图像。支持明场、暗场成像等多种成像模式，还可以结合拉曼光谱生成空间图像，满足不同材料的研究需求。
1.高通量面扫分光系统，能够更快地获取数据。包含当前视野范围内材料的一切光谱信息，可选择任意波长生成单色图，也可以选取任意一点抽取光谱。
2.滤光损耗极低(10%)。通过精确控制滤光角度，使成像范围横跨数百纳米，覆盖了可见光及近红外光区，光谱分辨率达5纳米以内。
3.全局成像技术——对视野中样品面扫成像，极大提升了扫描速度。在均匀照明系统的帮助下，能有效减少光源单点聚焦造成的样品损伤。
关键词：
高光谱
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