蛋白质二级结构的红外检测

蛋白质是与生命及各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质，机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质的参与。蛋白质是由不同氨基酸以肽键相连所组成的具有一定空间结构的生物大分子物质，其结构可分为以下4个结构层次：

图1 蛋白质的四个结构层次

我们所关注的蛋白质二级结构指的是蛋白质分子局部区域内，多肽链沿一定方向盘绕和折叠的方式，主要是分子内的氢键维系的局部空间排列，包括α螺旋、β折叠、转角、无规卷曲等。

常见的蛋白质二级结构分析的方法有四种：红外光谱法、X射线衍射法、圆二色谱法和荧光光谱法，其中红外光谱法的优势非常明显，可以宏观整体的鉴定复杂体系，测定不同状态、不同浓度和不同环境中的蛋白质和多肽，而且红外光谱法是一种快速的无损检测方法。傅里叶变换红外光谱（FTIR）法应用于蛋白质结构的定性和定量分析已有几十年的历史，是一种非常成熟的检测方法，人们对各类蛋白质二级结构红外吸收峰，以及同类蛋白质不同组分的特种频率和指认，都已非常明确，如下表所示。目前，蛋白质红外检测方法已广泛应用于药物研发、产品质量控制和出厂检测中。

表1 各类蛋白质二级结构红外吸收峰

根据样品的形态不同，蛋白质二级结构的红外测试方法分为两种：

1、液体样品

常用配置为红外光谱仪主机配套液体池附件和专门的蛋白质二级结构分析软件，还可以根据测试需要增加温度控制系统，如下图所示。

图2 蛋白质二级结构检测

红外液体池及温控装置

2、固体样品

常用配置为红外光谱仪主机配套压片机、衰减全反射（ATR）附件和测试软件，含分峰、差减、求导、卷积、去卷积、曲线拟合等功能，或可根据测试需要配套带温控功能的ATR附件。

FTIR用于蛋白质二级结构的分析实例已经非常多，不仅可以对蛋白质结构进行定性定量分析，如注射用人免疫球蛋白的检测，也可以对由温度、化学、物理和癌变等因素导致的变性蛋白质二级结构进行分析，下面力晶小天为大家举几个“栗子”：

人工抗原的鉴定

衰减全反射红外光谱法可以实现原位测定和实时跟踪，对于需要观察过程反应的实验具有很高的利用价值。通过对蛋白质酰胺吸收带的二阶求导和去卷积等，可以观察蛋白质分子部分或全部去折叠引起的二级机构的破坏以及相对含量的变化。对此，浙江农林大学化学系的郭明等人合成致癌物氨基甲酸乙酯的人工抗原后，通过衰减全反射红外光谱成功地对人工抗原蛋白质二级结构及其含量进行了分析。利用FTIR对人工抗原化学结构进行鉴定的应用很多，方法也非常成熟，除了ATR法，液体池法和压片法也经常被采用。

过敏原原肌球蛋白检测

水产品中，虾蟹(甲壳)类和贝类为水产品的主要致敏食物，而原肌球蛋白是其中主要的过敏原，其引起的过敏症状日趋复杂和严重。而传统的检测方法中，质谱技术的仪器成本和操作要求高，并且用SDS电泳分离蛋白导致蛋白变性，对被检食品样品有损害；PCR检测技术用来检测加工食品可能出现假阴性结果；免疫学检测技术、胶体金试纸条检测、磁性免疫层析法及生物传感器检测法等步骤繁琐且都需要抗体。上海海洋大学的卢瑛等人发明了红外衰减全反射法快速鉴定和检测过敏原原肌球蛋白。

图3 不同水产品的光谱

癌症早期诊断

随着FTIR技术的不断进步，为癌症的早期诊断提供了可能，针对这方面的报道也越来越多。例如，原发性胆囊癌细胞缺乏典型的临床表现，一经发现属中晚期，术后5年生存率不到5%。而早期原发性胆囊癌术后5年生存率可达100%，早期诊断是提高疗效、改善预后的关键。西安交大医学院diyi附属医院普外科的孙学军等人通过赛默飞世尔的红外光谱仪试验发现，胆囊癌组织与正常胆囊组织的红外光谱具有显著差异，可作为癌症早期诊断的手段。

中科院同步辐射实验室的马晓冬等人认为检测细胞和组织样品取样较为不便，所以根据中医理论——人的指甲在一定程度可以反映出内脏器官的生理病理变化，建立了通过指甲红外光谱判断消化道癌的方法。之前还有人通过指甲的红外光谱，对鼻咽癌进行早期诊断。

结直肠癌化疗疗效的实时监测

在结直肠癌的化疗中，常采用5-氟尿嘧啶诱导肿瘤细胞凋亡。临床上对放化疗效果的监测主要是通过电子显微结肠镜、CT和B超等手段，只是在组织水平进行监测，而组织变化之前肿瘤细胞内部构成早已发生改变，尚未出现临床症状和影像学改变。西安交大医学院diyi附属医院普外科的刘栋等人利用赛默飞世尔的iN10 MX型显微红外光谱仪，对不同时期肿瘤细胞中的脂类、氨基酸残基、DNA和蛋白质二级结构等进行检测，研究出实时无创监测肿瘤化疗疗效的有效方法。

图4 随凋亡时间延长蛋白质α螺旋和NH二级结构吸收峰强降低，

提示细胞α螺旋解链，细胞凋亡（a: Control; b: 12h; c: 24h; d: 48h）

不同制备条件对抗体蛋白的影响

免疫胶乳指特定抗体或抗原固定于胶乳颗粒表面形成具有免疫学性质的胶乳颗粒。传统物理吸附法固定大分子蛋白容易脱落，用共价偶联的方法制备免疫胶乳，蛋白质在吸附于胶乳颗粒表面的过程中结构会发生改变，不同偶联条件对蛋白质二级结构影响不同。华南理工大学的俞思明等人利用压片法测得免疫胶乳的红外透射光谱，并结合多种算法，分析了不同条件下共价偶联对抗体蛋白二级结构的影响。

随着FTIR软件和硬件技术的不断进步，相信未来红外光谱法在蛋白质检测各领域中的应用也会更加普遍，同时将由离体分析蛋白质向在体分析方向发展，这对化学和医学领域都将具有重大意义。