揭示单线态氧的神秘面纱：稳态瞬态荧光光谱

导言

对于单线态氧，可能很多人都感到很陌生。但是对于我们赖以生存的氧气，却再也熟悉不过。单线态氧是激发态的氧气分子，参与生物体内很多重要的生物化学反应，它犹如一把双*剑，既可以导致疾病的发生，又可以被人类应用在医学治疗、环境治理等领域。科学家们正在积极研究单线态氧在各种生物化学反应中的动力学过程及机理， 试图发掘出更多单线态氧可用于造福人类的潜能。

单线态氧是什么？

通常我们呼吸的氧气分子性质稳定，属于三线态氧分子3O2，如果我们从微观角度去看，氧气分子中两个自旋平行的电子分别占据两个2pπ*轨道，自旋多重性为3，称为三线态。当基态氧原子被激发后，原本两个2pπ*轨道中两个自旋平行的电子，既可以自旋相反地同时占据一个2pπ*轨道，也可以分别占据两个2pπ*轨道。这两种分子激发态下的自旋多重性均为1，也就是接下来要介绍的单线态氧分子1O2。

图1. 不同氧气分子的分子轨道能级图

从分子轨道上的电子分布可以看到，单线态氧由于解除了自旋限制，化学性质更活泼。它是一种含氧的非自由基活性物种，具有强氧化性，可以高选择性夺取电子。多年的研究表明，单线态氧在酶反应、细胞分裂、机体衰老、肿瘤等过程中都有参与作用。在一般情况下，细胞内单线态氧的浓度很低，而且单线态氧的产生和清除处于一个平衡的状态，不会引起机体损伤。但是如果由于某种诱因，导致这种平衡被破坏，就可能引起膜脂过氧化，严重时导致细胞死亡。此外，高活性的单线态氧也是一些化学和生物反应过程中重要的中间体，如光氧化反应[1]，光敏细胞毒性[2]，光动力学治疗[3,4]等。单线态氧产生机制对光动力疗法、抗癌药物和其他皮肤治疗的研究也都很重要。

单线态氧的产生可借助于光敏剂实现。光敏剂分子在氧气中被光辐照后，其激发三重态与基态氧发生反应，从而产生激发态的单线态氧。这些光敏剂包括玫瑰红、过渡金属络合物、卟啉、荧光素等。

图2. 光敏剂作用下单线态氧产生过程示意图

单线态氧的测量

目前探测单线态氧的方法主要有顺磁共振、荧光光谱法、化学捕获吸光度法、化学发光法、荧光探针法等。其中荧光光谱法已经成为检测单线态氧的常用手段。单线态氧的辐射复合发光位于1270nm，远远超出了人眼的可见波长范围，且其发光较弱，需要使用灵敏度较高的近红外探测器才可以检测到。近年来随着近红外探测器性能逐渐提高，可选激发光源也越来越多，为单线态氧的检测提供了很大的帮助。

本文采用卓立汉光公司的稳态瞬态荧光光谱仪OmniFluo990 对光敏剂孟加拉玫瑰红在光照下与氧气反应所产生的单线态氧进行测量，激发光源为532nm激光器，具有连续输出和脉冲输出两种模式。单线态氧的发射光谱分别采用卓立汉光的近红外InGAs探测器（型号：DInGaAs1700-03M）和滨松的近红外PMT（型号：R5509-73）测试得到。

实验样品准备：把孟加拉玫瑰红（Rose Bengal ，C20H2Cl4I4Na2O5）溶于分析纯无水乙腈，测试之前，在溶液中通入氧气饱和10分钟。单线态氧

稳态发光测试

稳态光谱测试使用532nm激光器，能量为80mW。发射侧光栅刻线密度为600g/mm，闪耀波长为750nm。扫描范围设置为1220-1340nm，步长1nm，带宽3nm，积分时间200ms，重复5次。发射侧使用800nm高通滤光片消除倍频峰信号干扰。近红外R5509-73 PMT在1274 nm处测到单线态氧的发光峰，如图3所示。

图3. 单线态氧稳态光谱图（采用R5509 PMT）

图4为使用卓立汉光近红外InGaAs检测器测试得到的结果。InGaAs为模拟信号检测器，灵敏度要比PMT低，图中可见单线态氧的发光峰信号强度相比NIR PMT要弱，谱线噪声也略大。尽管如此，我们依然可以看到很明显的单线态氧发光信号，包括峰位也和近红外PMT结果一致。

图4单线态氧稳态光谱图（采用InGaAs检测器）

瞬态发光测试

发光寿命测试对从机理上研究单线态氧所参与的众多光生物和光化学过程来说，具有重要的参考价值。单线态氧的寿命会受到光敏剂以及溶剂的影响，研究表明溶剂对其寿命的影响更大。单线态氧在溶液中很容易被多种溶剂淬灭，具有很强的溶剂依赖性。其中水就是一种*容易使单线态氧淬灭的溶剂，因为水中O-H键容易与单线态氧发生耦合反应。因此，本次实验中所采用的乙腈为分析纯的无水乙腈，避免单线态氧的信号被水淬灭。

本次实验所采用的瞬态光谱激发光源为532nm激光器，经过调制得到脉冲激光，检测器使用近红外R5509-73 PMT。图5数据经过拟合，得到单线态氧寿命为60.7μs。

图5. 单线态氧发光寿命测试（采用R5509 PMT）

单线态氧测试推荐仪器：

OmniFluo900稳态瞬态荧光光谱仪

配置推荐：

激发光源：532nm激光器，连续输出和脉冲输出两种模式可调
检测器：近红外检测器，可选卓立汉光自制InGaAs（型号：DInGaAs1700-03M）或者滨松的近红外PMT（型号：R5509-73）
发射单色器：标配三光栅塔轮，可安装多至三块光栅，其中近红外光栅可用于单线态氧近红外发光的分光。自动滤光片轮，用于安装800nm高通滤光片，消除倍频峰信号对单线态氧发光峰的干扰

参考文献

(1) Braun, A. M.; Maurette, M. T.; Oliveros, E. Photochemical Technology; Wiley: Chichester, U.K. 1991; pp 445-499.

(2) Cadenas, E. Annu. ReV. Biochem. 1989, 58, 79-110.

(3) Dougherty, T. J.; Gomer, C. J.; Henderson, B. W.; Jori, G.; Kessel, D.; Korbelik, M.; Moan, J.; Peng, Q. J. Nat. Cancer Inst. 1998, 90, 889-905.

(4) Ali, H.; an Lier, J. E. Chem. ReV. 1999, 9, 2379-2450.