奶粉营养成分检测与掺假筛查

概述奶粉是世界上贸易量最大的食品商品之一，每年出口量超过250万吨。[1] 从婴幼儿配方食品到烘焙糕点，很多食品中都会使用奶粉。然DairyGuard：奶粉营养成分检测与掺假筛查Near Infrared Spectroscopy应 用 文 章而，乳制品也是食品造假的常见对象之一，仅2011~2012年间美国药典委员会（USP）就记录了全球范围内137例因经济利益而发生的掺假事件。[2] 奶粉的营养价值关键在于蛋白质含量，但是目前蛋白质检测的标准方法仅仅是对氮元素含量进行简单测试，然后根据氮元素含量推算蛋白质含量。因此，掺入富含氮元素的化学物质可以人为增加蛋白质的表观含量，从而提高奶粉的价格。

经济利益驱使的掺假案例使得对于奶制品中三聚氰胺含量的限制非常严格。例如，美国FDA规定食品中三聚氰胺和氰尿酸的含量要低于2.5 ppm，婴儿奶粉中二者含量要低于1 ppm。[3]在上述含量水平上证明食品中不含这些掺假成分需要LC/MS/MS等灵敏度非常高的检测方法。[4]一些灵敏度高的实验室检测方法是非常重要的，但是这类方法往往也非常昂贵和耗时，可能导致无法获得具有代表性的样品。对于经济利益驱使的掺假行为来说，还有两个需要考虑的因素。首先，在ppm量级水平掺假基本上是无利可图的，因此确实掺假的样品中掺杂物质的含量应该更高。例如，让脱脂奶粉中氮元素占奶粉总质量的比例增加0.16%（对应于使蛋白质占奶粉总质量的比例增加1%），需要添加2400 ppm的三聚氰胺。其次，更难解决的问题在于，除了三聚氰胺以外还有其他各种各样可以添加的富含氮元素的化学物质。[5] 要有效地预防非法掺假行为，必须考虑目前已知掺假物质之外的其他可能性。

基于上述原因，在应对经济利益驱使的掺假行为时，不需要进行分离而是检测样品整体成分的“指纹图谱”技术具有非常重要的作用。近红外（NIR）光谱已经广泛用于食品、饲料和农业领域的蛋白质、水分、脂肪等营养和品质参数的定量分析。然而并不被人所熟知的是，近红外光谱也可以作为检测掺假样品的有力方法。近红外光谱测试几秒钟即可完成，包含了任意掺假成分在内的样品全部成分信息。检测过程中没有任何样品分离措施，因此需要恰当的化学计量学方法来区分奶粉基质和掺假物质的光谱信号。本文描述了DairyGuard 奶粉分析仪和Adulterant Screen 算法如何检测奶粉中含量远低于1%的7种掺假成分，不需要耗时建立偏最小二乘（PLS）或其他化学计量学校正模型。

什么是Adulterant Screen？以前使用近红外光谱进行掺假物质检测都是使用标准化学计量学方法（如图1所示）。以偏最小二乘回归为基础的定量分析方法能够比较准确的检测出三聚氰胺的含量。然而，这类靶向检测方法仅仅适用于建立校正模型时所针对的掺假物质，而且模型建立过程非常耗时——需要准备几十到几百个样品，并且准确测定这些样品中掺假物质的含量。另一种可供选择的思路是：使用SIMCA等基于主成分分析（PCA）的化学计量学方法，建立未掺假样品的光谱模型，根据待测样品光谱与该模型的匹配程度确定其是否合格。这类方法是真正的非靶向检测，能够检测任意掺假物质，但是无法给出不合格样品产生的原因（没有对掺假物质进行识别）。这类方法没有用到掺假物质的光谱，灵敏度也不会高于定量分析方法。基于光谱数据库检索的方法——即便是使用多元算法——的困难在于不能准确拟合样品基质的光谱变化，而且商业数据库的应用也非常有限

Adulterant Screen是专门为复杂基质中任意潜在掺假成分筛查而设计的新算法。该算法综合了非靶向筛查方法的通用性和简便性优势，以及靶向检测方法的高灵敏度优势。

Adulterant Screen如何工作？第一步，建立未掺假样品的光谱数据库，这与建立SIMCA模型的步骤类似。这个数据库应该尽可能包含各种类型的样品，例如包括不同批次、不同生产者、不同工艺参数的产品。然而，这些样品应该都是正常的，不需要像建立营养成分定量分析方法那样选择高杠杆值的特殊样品（例如含有特殊营养成分的产品）。样品光谱数量取决于基质复杂程度和所要求的灵敏度，一个典型的奶粉数据库大概包含几十个样品。第二步，建立掺假成分的光谱数据库。只需要纯物质的光谱即可，不用制备混合样品。DairyGuard软件中已经内置了一个包含19种富含氮元素的农业和工业化合物的光谱数据库。在数据库中添加新的掺假成分也非常简单，只要测量纯掺假成分的光谱，并将其拷贝到数据库文件夹即可。上 述 两 组 光 谱 导 入 软 件 之 后 ， 就 可 以 开 始 使 用Adulterant Screen技术了

Adulterant Screen与SIMCA比较：物理掺假样品通过喷雾-干燥法获得66个全脂奶粉样品，其中48个用于建立参考样品数据库，12个用于制备掺假样品，其余6个作为空白对照。所使用的潜在掺假成分为三聚氰胺、尿素、双缩脲、双氰胺、环丙氨嗪和氰尿酸。每种掺假成分在研细后分别以质量分数0.2%和2%的比例与奶粉充分混合均匀。通过其他方式（例如湿法混合）生产的奶粉样品可能产生不同的结果，需要对数据库中参考样品光谱进行调整。所有样品光谱都通过PerkinElmerDairyGuard奶粉分析仪系统进行测量，其中包含一台Frontier 近红外(NIR)光谱仪，配备NIRA II漫反射附件。每个样品累积扫描20秒，光谱分辨率为16 cm-1。使用PerkinElmer AssureID 软件建立SIMCA模型，置信度水平设置为默认值(99%)。参考样品数据库中所有48个样品的光谱均被用于建模。Adulterant Screen中24个样品的光谱用于建立模型，另外24个样品的光谱用于验证模型（设定阈值）。样品分析结果如表1所示，表明Adulterant Screen方法的检测灵敏度要优于SIMCA方法。

Adulterant Screen算法获得一个样品的光谱之后，该算法首先将其与参考样品PCA模型进行比较。然后，依次使用各种潜在掺假成分的光谱对该模型进行扩展。如果在模型中增加某种掺假成分的光谱之后，样品光谱的拟合程度得到显著增加，说明该样品很可能含有这种掺假成分。该算法也适用于同时含有多种掺假成分的样品，可以检索最多三种掺假成分的各种组合方式。该算法的输出结果是数据库中各种掺假成分的估计浓度、检测限和置信指标。对浓度的估计是根据数据库中掺假成分光谱与其在样品光谱中分量的相对强度，没有考虑到有效光程的差异。因此，这只是一种半定量的估计结果。检测限的估计结果也采取同样的方式。最后，置信指标显示了该掺假成分实际存在的可能性大小。置信指标和检测限估计值是非常重要的，因为该方法的灵敏度取决于掺假成分光谱与样品光谱的相似程度。如果要验证检测限的准确性，建议准备一些掺假成分含量略高于检测限的样品，看这些样品中的掺假成分是否能以较高的置信程度被检出。如果样品中的掺假成分不在数据库之内，或者奶粉本身与参考样品的匹配程度较差，软件会提醒用户该样品中可能存在未知异常成分。

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结论为了获得经济利益而在食品或食品原料中掺假的问题由来已久，也不可能在短时间内得以消除。我们需要使用各种可能的分析方法来应对食品掺假问题，近红外光谱在原材料检测中的广泛应用将使其起到非常关键的作用。PerkinElmer所提供的Adulterant Screen算法不仅保留了SIMCA等非靶向化学计量学方法的优势，而且通过潜在掺假成分光谱数据库获得了更高的灵敏度。通过简单的调整，该方法即可用于新产品类型或新掺假成分的筛查，不需要准备混合物样品建立校正模型。掺假成分光谱数据库还能提供更加丰富的诊断信息，让分析结果更加可靠，为下一步分析提供指导信息。PerkinElmer所提供的DairyGuard奶粉分析仪是一个完整的解决方案，预置了用于奶粉检测的Adulterant Screen方法（以及相关的定量分析方法），所有功能都集成于简单的触屏操作界面。